2021-12
1、溶劑效應(yīng)
?溶劑效應(yīng)（solvent effect）亦稱“溶劑化作用”。指液相反應(yīng)中，溶劑的物理和化學性質(zhì)影響反應(yīng)平衡和反應(yīng)速度的效應(yīng)?？赡茉斐缮V峰展寬、分叉、保留時間漂移、峰面積變化，雙峰等現(xiàn)象。與此同時，較早洗脫的峰出現(xiàn)前延或分叉，較晚洗脫的峰峰形正常【1】。
? ? ? ? ??溶劑效應(yīng)主要產(chǎn)生于進樣過程，究其原因，樣品溶液（包括樣品分子和溶劑分子）在進樣過程中實際上存在著三個進程，一是樣品分子與流動相混合，二是樣品分子與固定相發(fā)生相互作用，三是樣品分子在流動相的推動下被洗脫。當樣品到達色譜柱時樣品的這三個進程是同時進行的，一旦樣品溶液與流動相兼容性不好，樣品未能充分進入良好的預(yù)分離狀態(tài)即被倉促洗脫，就會產(chǎn)生引起怪異峰型的溶劑效應(yīng)，影響分離度和分析結(jié)果的準確性。
2、溶劑效應(yīng)消除器
? ? ? 溶劑效應(yīng)消除器又叫峰形前延抑制器，它的設(shè)計原理是在色譜柱前端引入一個特殊結(jié)構(gòu)的腔體，使其內(nèi)部空腔在色譜系統(tǒng)平衡過程中充滿流動相，進樣時樣品溶液流經(jīng)腔體，在其極小體積的空腔內(nèi)產(chǎn)生微小的湍流，使樣品溶液到達色譜前與存留與空腔內(nèi)的流動相高效混合，優(yōu)化了樣品分子所處的周圍環(huán)境，使同時進行的三個進程得到了微妙的改善，使樣品在到達色譜柱之前即完成了樣品溶液與流動相的兼容性問題，提前進入預(yù)分離狀態(tài)，樣品到達色譜柱后即可以最佳的狀態(tài)被流動相洗脫進行分析分離，由此消除了溶劑效應(yīng)。（來自譜寧科技）
3、應(yīng)用實例
塞來昔布（Celecoxib），即4[5-4（4-甲苯基）-3-（三氟甲基）-1氫-1-吡唑-1-基]苯磺酰胺，是第一個選擇性COX-2抑制劑，也是目前全球處方量最大的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥（NSAIDs），不僅具有顯著鎮(zhèn)痛療效，能顯著減輕關(guān)節(jié)觸痛、疼痛和關(guān)節(jié)腫脹，而且具有優(yōu)越的胃腸道安全性。已知塞來昔布原料藥生產(chǎn)過程中可有由剩余起始物料和第二步反應(yīng)物料反應(yīng)生成雜質(zhì)D，該化合物具有基因毒性雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)苯肼結(jié)構(gòu)，被ICH M7定義為3類基因毒性雜質(zhì)（即具有警示結(jié)構(gòu)，與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)；無致突變性數(shù)據(jù)），需要對其進行嚴格的限度控制。為更好的監(jiān)控塞來昔布膠囊產(chǎn)品質(zhì)量，按照ICH規(guī)定基因毒性雜質(zhì)的人體攝入量不能超過每人每天1.5μg，我們參考美國藥典論壇方法【2】建立了塞來昔布雜質(zhì)D的HPLC-UV測定法，對塞來昔布膠囊中可能存在的雜質(zhì)D進行檢測，可以更好的控制塞來昔布及其制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。
? ? ? ?塞來昔布雜質(zhì)D結(jié)構(gòu)式如下：
? ? ? ?塞來昔布膠囊雜質(zhì)D檢測方法描述如下：
? ? ? ?①流動相。流動相A：0.10%磷酸溶液；流動相B：甲醇-乙腈-水（50:20:30）；如下梯度洗脫：
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? ? ? ②色譜柱：Purospher STAR RP-18（4.0mm×5.5cm，3μm）或性能相當?shù)纳V柱。
? ? ? ③檢測波長：330nm。
? ? ? ④柱溫：30℃。
? ? ? ⑤進樣體積：20μl。
? ? ? ⑥溶劑：甲醇-乙腈（80:20）。
? ? ? ⑦供試品溶液：取本品20粒，傾倒出內(nèi)容物，計算其平均裝量，并混合均勻，取內(nèi)容物約2.2g（相當于塞來昔布1.6g），精密稱定，置20ml量瓶中，加入約16ml稀釋液，超聲5min使溶解，放冷，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，4000rpm/min離心5min，取上清液，即得。
? ? ? ⑧對照品溶液：取塞來昔布雜質(zhì)D對照品約15mg，精密稱定，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)D儲備液，精密量取雜質(zhì)D儲備液1ml至50ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml至50ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻即得。（雜質(zhì)D濃度約為0.3μg/ml）。
實驗1
? ? ??參考美國藥典論壇色譜條件，在Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀上進樣雜質(zhì)D對照品溶液，結(jié)果顯示雜質(zhì)D峰出現(xiàn)峰前延（如圖1）。
實驗2
? ? ?考慮到樣品配制用溶劑和流動相不一致，存在樣品溶液與流動相的兼容性問題，可能引起溶劑效應(yīng)。為證明溶劑效應(yīng)的存在，改用流動相稀釋雜質(zhì)D對照品溶液，在相同儀器上重新進樣，結(jié)果顯示雜質(zhì)D峰形正常（如圖2）。證明確實存在溶劑效應(yīng)。
實驗3
? ? ?參考美國藥典論壇色譜條件，在島津LC2030型高效液相色譜儀上重新進樣雜質(zhì)D對照品溶液，發(fā)現(xiàn)不使用流動相稀釋的雜質(zhì)D對照品溶液色譜圖雜質(zhì)D峰形卻是正常的（如圖3）。
? ? ? ? ??對比兩臺高效液相色譜儀的構(gòu)造，島津LC2030連接管線采用了0.3mm內(nèi)徑的不銹鋼管（如圖4），比Agilent 1260Ⅱ的0.17mm內(nèi)徑不銹鋼管線（如圖5）粗了將近一倍，樣品從進樣至進入色譜柱之前，在0.3mm管線中有足夠大的體積使樣品溶液和流動相充分混合，樣品提前進入預(yù)分離狀態(tài)，消除了溶劑效應(yīng)帶來的影響，使色譜圖雜質(zhì)D峰型正常。
實驗4
? ? ? ? ??市面上能提供峰前延抑制器的產(chǎn)品的公司眾多，此次試驗采用的是上海譜寧分析技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Pntulips?郁金香系列Solvnet-Smoother 溶劑效應(yīng)消除器（Solvs-AB型），將消除器接于Agilent 1260Ⅱ型的進樣器與色譜柱之間，參考美國藥典論壇色譜條件進樣雜質(zhì)D對照品溶液。結(jié)果顯示雜質(zhì)D峰形正常（如圖6）。
4、討論
液相色譜方法開發(fā)中應(yīng)盡量避免使用比流動性強的溶劑來配備樣品，通?？刹捎昧鲃酉嘧鋈軇?。如果不方便更換樣品溶劑，要注意可能的溶劑效應(yīng)使色譜圖中較早洗脫出來的色譜峰發(fā)生譜帶加寬和（或）扭曲變形；同時需關(guān)注此類方法的方法轉(zhuǎn)移時，因為不同實驗室檢測設(shè)備的差異導致可能的方法轉(zhuǎn)移失敗。此時在色譜系統(tǒng)中加裝峰前延抑制器是一種不錯的解決方案。
參考文獻
[1] Lee H K , Hoffman N E . INJECTION SOLVENT EFFECT ON PEAK HEIGHT IN ION-EXCHANGE HPLC[J]. Journal of Chromatographic Science, 1992,30(10):415-421.
[2] 43（6）In-Process Revision Celecoxib.
