2024-06
高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。鑒于高效液相色譜法在本實(shí)驗(yàn)室為最重要的分析檢測(cè)手段，而藥物研發(fā)中的很多問(wèn)題都能從色譜圖中得到很好的反映?，F(xiàn)結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)和大家實(shí)踐中可能會(huì)經(jīng)常遇到的一些問(wèn)題從以下九個(gè)方面進(jìn)行了整理匯總，希望對(duì)大家有所幫助。
一、拖尾峰
所謂拖尾峰是指前沿陡峭，后沿較前沿平緩的不對(duì)稱峰。色譜峰拖尾，是我們?cè)谶M(jìn)行色譜實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的最常見(jiàn)問(wèn)題。按《中國(guó)藥典》（通則0512高效液相色譜法）要求，通常允許拖尾因子在0.95～1.05之間，因此少量的色譜峰拖尾現(xiàn)象是正常的。但是經(jīng)常是隨著項(xiàng)目的推進(jìn)，由于色譜柱的老化，峰的拖尾會(huì)隨著時(shí)間而增加。出現(xiàn)拖尾峰的常見(jiàn)原因及解決思路如下：
1、篩板阻塞：柱子兩頭的過(guò)濾篩板如果堵塞，樣品就會(huì)在篩板部分受阻而形成時(shí)間延遲，使得樣品在柱后流出時(shí)峰型形成拖尾。需要反沖色譜柱，或者更換篩板。
2、色譜柱塌陷：色譜柱塌陷是色譜分析中常見(jiàn)的問(wèn)題，由柱子老化、柱內(nèi)壓力過(guò)大、柱內(nèi)溶液過(guò)濃等原因造成，不能對(duì)物質(zhì)形成保留，使得物質(zhì)不在固定相上保留而隨流動(dòng)相流出，但是又還有一點(diǎn)柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色譜柱或者更換色譜柱。
3、色譜柱未封端：硅羥基與樣品作用，加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值，純化樣品。使用未封端的色譜柱導(dǎo)致的拖尾峰色譜圖見(jiàn)圖1，加三乙胺調(diào)節(jié)pH值后峰型變得尖銳色譜圖見(jiàn)圖2。
4、死體積或柱外體積過(guò)大：將系統(tǒng)中各連接處死體積降至最低，對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管。
5、柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相。
6、色譜柱有污染：更換色譜柱或者采用有機(jī)溶劑梯度洗脫1小時(shí)以上，以沖洗柱子。
7、流動(dòng)相pH值選擇錯(cuò)誤：一般化合物以分子狀態(tài)出峰，離子狀態(tài)是比較不穩(wěn)定的。酸性化合物在pH＜pKa-2溶液中以分子狀態(tài)為主，堿性化合物在pH＞pKa＋2溶液中以分子狀態(tài)為主。如果流動(dòng)相pH值選擇不合適，就會(huì)表現(xiàn)出拖尾。調(diào)節(jié)PH值可抑制分子解離，改善拖尾，更有利于得到對(duì)稱峰。
二、前延峰
在反向色譜中色譜峰的前延不如色譜峰的拖尾普遍。與拖尾相同，小幅度的色譜峰的前延是可以接受的。前延峰又稱前伸峰、伸舌頭峰。前沿平緩，后沿陡峭的不對(duì)稱色譜峰稱前延峰。出現(xiàn)前延峰的可能原因及解決思路如下：
1、樣品過(guò)載：被保留的樣品在正常出峰時(shí)間前陸續(xù)出來(lái)，形成前延峰。降低樣品含量。
2、樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：當(dāng)樣品溶劑的洗脫能力大大強(qiáng)于流動(dòng)相時(shí)會(huì)出現(xiàn)前延峰，例如，在反相色譜中用乙腈做樣品溶劑，而流動(dòng)相的洗脫力較弱時(shí)會(huì)出現(xiàn)前延峰。選擇流動(dòng)相或者接近流動(dòng)相的比例作為樣品溶劑。
3、色譜柱損壞：色譜柱柱效損失，不能對(duì)物質(zhì)形成保留。更換色譜柱。色譜柱損壞導(dǎo)致的前延峰色譜圖見(jiàn)圖3，更換色譜柱后前延峰消失且峰型正常色譜圖見(jiàn)圖4。
4、流動(dòng)相梯度不合適：在大峰前有小峰出現(xiàn)，假象前延峰，即大峰前包埋了沒(méi)有分開(kāi)的小峰。調(diào)整流動(dòng)相洗脫梯度。
5、柱溫：有些樣品在常溫下分離可見(jiàn)前延峰，提高溫度后前延峰的現(xiàn)象消失。
三、峰寬大
寬大峰可能是分裂峰或者扭曲峰的前身。對(duì)于新的色譜柱來(lái)說(shuō)，寬峰的塔板數(shù)比指定的塔板數(shù)要少得多。出現(xiàn)異常寬峰的可能原因及解決思路如下：
1、色譜柱污染或失效，造成塔板數(shù)降低：更換同樣類型的色譜柱，如果新柱子可以提供對(duì)稱的色譜峰，則用強(qiáng)溶劑沖洗舊柱子。色譜柱污染導(dǎo)致峰寬變寬且變形峰色譜圖見(jiàn)圖5，更換色譜柱后寬大峰消失且峰型變得尖銳峰色譜圖見(jiàn)圖6。
2、檢測(cè)器對(duì)反應(yīng)時(shí)間或池體積響應(yīng)過(guò)大：減少響應(yīng)時(shí)間或使用更小的流通池。
3、柱外峰寬效應(yīng)。一根很好的專用柱用于另一液相色譜系統(tǒng)引起塔板數(shù)降低，說(shuō)明新系統(tǒng)有很大的柱外峰寬效應(yīng)。
4、發(fā)生化學(xué)效應(yīng)，多數(shù)是流動(dòng)相和固定相相互作用所致，改變流動(dòng)相可使寬峰有所改善。
四、倒峰
通常情況下,色譜峰是從底部向上升的,但是當(dāng)某些因素影響到色譜柱內(nèi)的流動(dòng)相或樣品時(shí),就可能出現(xiàn)倒峰現(xiàn)象。 液相色譜倒峰的原因可能有很多,下面列舉幾個(gè)常見(jiàn)的原因：
1、樣品折射率?。菏静钫酃鈾z測(cè)器測(cè)的信號(hào)是折射率，出現(xiàn)倒峰的原因是組分的折射率小于流動(dòng)相。
2、密度的原因：密度不一樣，出來(lái)的峰正倒不一樣。
3、進(jìn)樣所致：進(jìn)樣時(shí)，樣品對(duì)原有流動(dòng)相產(chǎn)生瞬間阻斷，然后瞬間涌流，所以產(chǎn)生先倒后高的“溶劑峰”。
4、流動(dòng)相中含有離子對(duì)試劑。流動(dòng)相使用離子對(duì)試劑導(dǎo)致倒峰色譜圖見(jiàn)圖7。
倒峰基本上不能避免，但試著使用與流動(dòng)相相同的溶劑作為溶樣溶劑，另外進(jìn)樣之前注意平衡跟沖洗參比池，這些操作會(huì)使倒峰減小一些。
五、裂峰
色譜峰分裂通常是由多種因素引起的，包括色譜柱問(wèn)題、樣品問(wèn)題、流動(dòng)相問(wèn)題以及操作問(wèn)題等。以下是一些常見(jiàn)的原因及其解決方法：
1、樣品復(fù)雜：樣品基質(zhì)復(fù)雜或分析多種樣品，導(dǎo)致柱污染或部分阻塞濾片。通常使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。色譜柱污染裂峰色譜圖見(jiàn)圖8，使用強(qiáng)極性溶劑沖洗色譜柱后峰型正常色譜圖見(jiàn)圖9。
2、流動(dòng)相pH≥7：流動(dòng)相偏堿性使硅膠溶解，導(dǎo)致柱塌陷。開(kāi)發(fā)新的方法或者選擇適合的色譜柱，使用專門(mén)的柱子。
3、溶劑比流動(dòng)相的強(qiáng)度大：可能產(chǎn)生裂峰或?qū)挿澹蓸悠妨繘Q定 （溶劑化效應(yīng)），解決辦法通常是用流動(dòng)相做溶劑溶解樣品。
六、刺峰
刺峰是指窄而尖銳的色譜峰。在使用液相色譜儀時(shí)，基線上偶然出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)尖銳峰，甚至重復(fù)出現(xiàn)大量毛刺。顯然有些會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，降低精度和準(zhǔn)確度，因此需要及時(shí)解決?；€出現(xiàn)毛刺的可能原因有很多，下面將為大家介紹常用的解決方法。
1、色譜柱沖洗不徹底：基線出現(xiàn)毛刺時(shí)，最簡(jiǎn)單的方法就是徹底清洗柱子。首先可以嘗試用純水或乙腈等溶劑，進(jìn)行多次反復(fù)洗滌柱子，然后做多次反沖，直至基線穩(wěn)定。如果清洗無(wú)效，可能需要更換柱子。
2、柱子老化或受污染：需要及時(shí)更換。同時(shí)，要做好柱子的保存工作，避免外部因素對(duì)柱子的影響。
3、溶劑影響：溶劑可能也是引起基線產(chǎn)生毛刺的重要原因之一，因此，如果發(fā)現(xiàn)基線上的毛刺很多，可以嘗試更換溶劑，或者把已有的溶劑再進(jìn)行一次純化處理，然后重新使用。
4、進(jìn)樣器：進(jìn)樣器對(duì)于液相色譜儀的工作起到了很重要的作用，因此進(jìn)樣器的任何問(wèn)題都可能會(huì)導(dǎo)致基線出現(xiàn)毛刺。因此，需要及時(shí)檢查進(jìn)樣器的情況，看看是不是需要更換進(jìn)樣器或者清洗進(jìn)樣器等。
對(duì)于偶然出現(xiàn)的刺峰，可觀察，如不重復(fù)出現(xiàn)，可不處理。序列運(yùn)行過(guò)程中重復(fù)進(jìn)樣偶然出現(xiàn)的刺峰色譜圖見(jiàn)圖10、11，同一序列運(yùn)行過(guò)程中重復(fù)進(jìn)樣的正常色譜圖見(jiàn)圖12。
七、基線漂移
基線漂移在梯度洗脫中是很普遍的，A、B溶劑在檢測(cè)器上的響應(yīng)差異是造成基線漂移的原因，但是對(duì)于異常的基線漂移或者在等度洗脫中出現(xiàn)基線漂移，可能的原因及解決思路如下：
1、室溫、柱溫波動(dòng)：即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)，通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。使用柱溫箱，控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器。
2、流動(dòng)相不均勻：流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。使用HPLC級(jí)的溶劑，流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣處理。流動(dòng)相混合不均勻?qū)е禄€波動(dòng)大色譜圖見(jiàn)圖13，重新混合流動(dòng)相并進(jìn)行脫氣處理色譜圖見(jiàn)圖14。
3、流通池被污染或有氣體：用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。
4、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化：更改配比或流速，為避免這個(gè)問(wèn)題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。
5、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)：以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。
八、基線波動(dòng)
基線規(guī)律的上下起伏稱為基線波動(dòng)。產(chǎn)生基線波動(dòng)可能的原因及解決思路如下：
1、在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵等系統(tǒng)中有空氣(尖銳峰)：流動(dòng)相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。
2、漏液：檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。
3、流動(dòng)相混合不完全：用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑，維修或更換混合器，在流動(dòng)相不走梯度時(shí)，建議不使用泵的混合裝置。
4、溫度影響(柱溫過(guò)高，檢測(cè)器未加熱)：使用柱溫箱，減少溫度差異或加上熱交換器。溫濕度波動(dòng)較大導(dǎo)致基線波動(dòng)大色譜圖見(jiàn)圖15，嚴(yán)格控制液相室溫濕度和柱溫色譜圖見(jiàn)圖16。
5、在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲)：斷開(kāi)LC、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來(lái)自于外部，加以更正。 采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。
6、泵振動(dòng)：在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。
7、檢測(cè)器燈能量不足：更換燈。
8、流通池污染：用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池。
9、色譜柱填料流失或阻塞：更換色譜柱或者沖洗色譜柱。
九、分離度不夠
1、流動(dòng)相梯度洗脫設(shè)置不合理：優(yōu)化梯度洗脫程序。流動(dòng)相梯度洗脫設(shè)置不合理色譜圖見(jiàn)圖17、18，流動(dòng)相梯度優(yōu)化后完全分離色譜圖見(jiàn)圖19。
2、流動(dòng)相污染或變質(zhì)(引起保留時(shí)間變化)：重新配置流動(dòng)相。
3、保護(hù)柱或分析柱阻塞：去掉保護(hù)柱進(jìn)行分析，如果必要?jiǎng)t更換保護(hù)柱；如果分析柱阻塞，可進(jìn)行反沖；如果問(wèn)題仍然存在色譜柱可能被強(qiáng)保留的污染物損壞，建議使用恰當(dāng)?shù)脑偕绦?；如果?wèn)題仍然存在，進(jìn)口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。
4、色譜柱選擇不合理：可以更換柱效更高例如小粒徑的色譜柱。
綜上，正確使用色譜柱和選擇流動(dòng)相才是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室分析人員都應(yīng)該熟練掌握區(qū)分出現(xiàn)異常色譜峰的原因，并對(duì)于一些常見(jiàn)的問(wèn)題分析應(yīng)該做到游刃有余，才能在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)異常的時(shí)候及時(shí)解決問(wèn)題，提高工作效率，項(xiàng)目才能順利推進(jìn)。
