2022-01
1.原子吸收分光光度法
原子吸收光譜法（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS），又稱原子吸收分光光度法，是基于待測(cè)元素的基態(tài)原子蒸汽對(duì)其特征譜線的吸收，由特征譜線的特征性與譜線被減弱的程度對(duì)待測(cè)元素進(jìn)行定性定量分析的一種儀器分析的方法。
原子吸收分光光度法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、精密度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于藥品中作為雜質(zhì)存在的特定元素含量的測(cè)定，中國(guó)藥典四部使用原子吸收分光光度法進(jìn)行元素雜質(zhì)砷、鎘、鉛、汞、銅的測(cè)定。
2.AAS方法的方法驗(yàn)證要點(diǎn)
為證明建立的方法適用于相應(yīng)檢測(cè)要求，在建立藥品分析方法時(shí)需對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)EDQM出版的Technical Guide for the Elaboration of Monographs中相關(guān)介紹，原子吸收分光光度法方法除常規(guī)進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍項(xiàng)驗(yàn)證外，需要重點(diǎn)關(guān)注以下幾項(xiàng)內(nèi)容：
? ? ? 2.1.專屬性
理論上，選取合適的光源和波長(zhǎng)，使用原子吸收分光光度法進(jìn)行特定元素的測(cè)定，方法專屬性是合格的。但是，因?yàn)樵右圆贿B續(xù)的線光譜形式發(fā)射或吸收輻射，由于光學(xué)和/或化學(xué)因素，原子吸收分光光度法可能會(huì)遇到干擾。如果采用直接標(biāo)準(zhǔn)曲線法（中國(guó)藥典2020年版通則0406第一法），這些干擾因素可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)定的系數(shù)誤差或降低方法的靈敏度，原子吸收分光光度法最重要的誤差來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作以及基質(zhì)的干擾。所以，原子吸收方法需要進(jìn)行專屬性驗(yàn)證。
2.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線
制備水溶性對(duì)照品溶液，并對(duì)分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的不同濃度水平的對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。必須制備的不同濃度水平對(duì)照品溶液的數(shù)量取決于所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法。為證明標(biāo)準(zhǔn)曲線符合直線回歸模型，應(yīng)至少配制5份不同濃度的對(duì)照品溶液；拋物回歸模型也要求至少配制5份對(duì)照品溶液。首選的對(duì)照品溶液濃度水平是在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)平均分布。
一般地，每個(gè)濃度水平至少測(cè)定5次。
校準(zhǔn)程序通常是通過目視就能判斷合格與否。但不能僅僅使用標(biāo)準(zhǔn)曲線圖來證明校準(zhǔn)程序的適用性。
①以測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程和置信區(qū)間，測(cè)定的數(shù)據(jù)點(diǎn)應(yīng)與擬合曲線想適配。
? ? ? ?②殘差（即測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)曲線上的估計(jì)值之間的差），繪制殘差與濃度的關(guān)系，當(dāng)建立了適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，殘差應(yīng)隨機(jī)分布在x軸附近。
? ? ? ?2.3.基質(zhì)效應(yīng)
當(dāng)以水溶性對(duì)照品溶液為標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行評(píng)估，必須確保供試品溶液和水溶性對(duì)照品溶液具有相近的靈敏度。當(dāng)采用線性回歸模式時(shí)，可通過標(biāo)準(zhǔn)加入法與水溶性標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距的比較，來確定標(biāo)樣與供試品溶液間的檢測(cè)靈敏度的差異。對(duì)兩種線性回歸的截距估計(jì)值的精密度程度，取決于測(cè)定數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量及其在擬合曲線上的分布情況。因此，兩種回歸曲線的建立過程中應(yīng)有足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)（大于5個(gè)），這些標(biāo)樣的濃度應(yīng)主要分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定范圍內(nèi)。
2.4.檢測(cè)限和定量限
為了對(duì)檢測(cè)限和定量限進(jìn)行估算，需要配制具有代表性的空白溶液進(jìn)行測(cè)定。
基質(zhì)空白為首選，因?yàn)樵撊芤褐谐舜郎y(cè)物質(zhì)外，含有供試溶液中的所有組分。但是，當(dāng)不能獲得基質(zhì)空白時(shí)，可以按照供試品溶液的配法，制備含有供試品中所含全部試劑的試劑空白溶液。
3.驗(yàn)證實(shí)例：
? ? ?根據(jù)中國(guó)藥典2020年版，葡萄糖酸鋅原料藥的鉛鹽檢測(cè)采用理化分析方法，方法中使用到氰化鉀，氰化鉀屬于劇毒物質(zhì)，所以改用原子吸收分光光度法（標(biāo)準(zhǔn)加入法）進(jìn)行檢測(cè)。
? ? ? 3.1.溶液配制如下：
? ? ??標(biāo)準(zhǔn)曲線法線性溶液：分別精密量取10μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，置250ml分液漏斗中，加入9mol/L鹽酸溶液20ml、水20ml，再加入抗壞血酸-碘化鈉溶液40ml、三正辛基氧膦溶液10ml，振搖30s，靜置分層，棄去水相，將有機(jī)相放入10ml具塞刻度試管中。
? ? ??標(biāo)準(zhǔn)加入法線性溶液：分別取葡萄糖酸鋅原料藥2.0g，精密稱定，置100ml燒杯中，加9mol/L鹽酸溶液20ml使溶解，用20ml水沖洗轉(zhuǎn)移到250ml分液漏斗中，精密加入10μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml，再加入抗壞血酸-碘化鈉溶液40ml、三正辛基氧膦溶液10ml，振搖30s，靜置分層，棄去水相，將有機(jī)相放入10ml具塞刻度試管中。
? ? ? 3.2.分別進(jìn)樣檢測(cè)，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行結(jié)果對(duì)比：
? ? ? ?驗(yàn)證結(jié)果
? ? ? ??
? ? ? ?加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值：0.014646/0.015808=0.93;
?加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線截距偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線截距偏差比值：0.0016813/0.0026676=0.63;
?截距偏差比值顯然太小，說明葡萄糖酸鋅原料藥的鉛鹽檢測(cè)方法存在基質(zhì)干擾，需要采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行樣品檢測(cè)。
3.3.使用標(biāo)準(zhǔn)加入法的線性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)和定量限估算：
空白溶液配制：取原料藥2g，精密稱定，置100ml燒杯中，加9mol/L鹽酸溶液20ml使溶解，用20ml水沖洗轉(zhuǎn)移到250ml分液漏斗中，加入抗壞血酸-碘化鈉溶液40ml、三正辛基氧膦溶液10ml，振搖30s，靜置分層，棄去水相，將有機(jī)相放入10ml具塞刻度試管中。平行配制5份。
空白溶液檢測(cè)：在283.3nm處，使用空氣-乙炔火焰，將原子吸收分光光度儀調(diào)至最佳工作狀態(tài)，以甲基異丁基甲酮調(diào)零，分別測(cè)定試劑空白溶液各1次，記錄系列溶液的吸光度。
平行5份空白溶液的吸光度值分別為-0.0014、-0.0013、-0.0013、-0.0015、-0.0015，算得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0001。
結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法的線性回歸方程y=0.015808x-0.0079676，斜率為0.015808。
? ? ? ?算得檢測(cè)限為：3.3×0.0001÷0.015808=0.0209μg/ml；定量限為：10×0.0001÷0.015808=0.0632μg/ml。
4.結(jié)果討論
? ? ?在建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，如果法定方法不適用，需要轉(zhuǎn)移思路，進(jìn)行方法開發(fā)。建立能夠顯著改善靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和專屬性的新方法，方法驗(yàn)證需要系統(tǒng)、全面、科學(xué)，以證明其適用于指定用途，而不是僅僅為了進(jìn)行方法驗(yàn)證而驗(yàn)證。
參課文獻(xiàn)
[1] Technical Guide for the Elaboration of Monographs，European Pharmacopoeia
[2] 中國(guó)藥典2020年版-葡萄糖酸鋅
